Exosomas: ¿La nueva “panacea” de los biomarcadores?

09/08/2015 3 comentarios
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Actualmente, los biomarcadores son uno de los temas de moda en la investigación aplicada a la biomedicina. Por sus características y contenido, los exosomas aparecen como interesantes candidatos de investigación, los cuales son estudiados por muchos equipos científicos a nivel mundial. Pero ¿por qué son tan apetecidos? Su biología nos responde.

Una de las preguntas clásicas en el campo la biomedicina, nos cuestiona si es posible efectuar una detección temprana de diversas enfermedades, de forma de potenciar la efectividad de los tratamientos y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Probablemente, la respuesta para la mayoría (o la totalidad) de los grupos de investigación enfocados en este tema sea afirmativa, invirtiendo una importante parte de su tiempo en el estudio del contenido de ciertas moléculas en diversos tejidos. Interesantemente, la presencia de ciertas enfermedades se correlaciona con cambios en el contenido molecular, tanto al interior como exterior de las células. De esta forma, la detección temprana de estos cambios puede dar cuenta de la presencia de algunas enfermedades, sirviendo estas moléculas como marcadores biológicos (en general, biomarcadores) de cada condición.

En la actualidad, diversos estudios han enfocado sus esfuerzos en la caracterización del contenido de moléculas en fluidos de fácil acceso, como sangre, orina, saliva, etc. Pero un nuevo foco de interés, consiste en el estudio de la composición de vesículas extracelulares circulantes en dichos fluidos.

Existen diversos tipos de vesículas extracelulares, las cuales pueden ser nombradas de diversas formas en razón a sus características físicas (como tamaño), la fuente celular que la produce o su localización. Esta última es una de las más utilizadas, derivando de ella el concepto de "exosoma": cuerpos ubicados al exterior de la célula (extracelulares). Sin embargo, con los aportes de grupos de investigación como los de Jhonstone, Harding y Thèry, se ha logrado comprender que estas vesículas poseen características aún más específicas que determinan su identidad, más allá de su localización celular.

- Los exosomas y su contenido

Imagen1.jpgEstas vesículas (Fig. 1A) corresponden a estructuras extracelulares esféricas, con una longitud entre los 40 y 100 nm de diámetro aprox., y cuya biogénesis ocurre en el interior de los denominados cuerpos multivesiculares: un conjunto especializado de endosomas que contienen vesículas adosadas a su membrana, las cuales pueden ser destinadas a degradación (vía del lisosoma), o secreción (vía de liberación vesicular) (Fig. 2). Aparentemente, todos los tipos celulares son capaces de producir exosomas, los que una vez secretados se distribuyen en los diversos fluidos corporales de manera periférica.

Al interior de los exosomas (lumen), se han detectado diversos tipos de moléculas orgánicas (Fig. 1B). En su membrana, se ha visto un enriquecimiento especial de lípidos saturados (esfingomielina, fosfatidilserina y colesterol), los cuales se relacionan con la presencia de las denominadas "balsas lipídicas". Por otra parte, en el lumen se han observado proteínas asociadas al citoesqueleto (como actina y tubulina), enzimas (como aquellas relacionadas con el metabolismo de la energía), asociadas a tráfico vesicular (por ej., la familia Rab), moléculas de adhesión celular (tetraspaninas) y otras relacionadas con la biogénesis de los exosomas (proteínas del complejo ESCRT, proveniente de la sigla en inglés "Endosomal Sorting Complex Required for Transport"). Así mismo, diferentes clases de ARNs codificantes (ARNs mensajeros) y no codificantes (como microARNs) han sido estudiados y detectados al interior de estas vesículas. Sin embargo, se cuenta con poca información respecto al contenido de hidratos de carbono que los exosomas podrían portar, aunque se cree que una parte de ellas pueden estar asociadas a otras moléculas (por ej., en forma de glicoproteínas).

 

Imagen2.jpg

Aparentemente, no todas las moléculas tienen la oportunidad de ingresar al interior de los exosomas, aspecto que parece variar y depender de la tipología celular. Se ha visto que la adición de ubiquitina o la asociación de SUMO a otras proteínas (ubiquitinaciones y sumoilaciones, respectivamente), favorecen su carga al interior de los exosomas. Así mismo, entrada de microARNs al lumen de estas vesículas, guardaría relación con la secuencia de nucleótidos en su extremo 3' o su interacción con ribonucleoproteínas (proteínas de unión a ácidos nucleicos). Aun cuando estas relaciones han sido documentadas, los mecanismos por los que dicha carga es regulada, permanecen desconocidos.

 


- Funciones y mecanismos de acción de los exosomas

A la fecha, se encuentran disponibles en bases de datos, referencias sobre publicaciones que señalan diferentes funciones de los exosomas. Sorprendentemente, estas vesículas estarían relacionadas con distintos procesos celulares, tanto de proliferación, toxicidad, control de la actividad celular, entre otros. Por ejemplo, algunas publicaciones señalan a estas vesículas como importantes participantes modulación de la respuesta inmune en los organismos, los cuales son eventos clave, por ejemplo, para la diseminación o protección contra enfermedades como el cáncer o la infectividad de ciertos parásitos. Así mismo, serían importantes en la diferenciación de células madre (de distintos orígenes), y los procesos regenerativos.

Imagen3.jpgSin embargo, los mecanismos por los cuales estas vesículas son capaces de controlar las diferentes respuestas, no se conocen con claridad. De forma aparente, para que este control se realice, la entrega del contenido vesicular, la interacción del exosoma con la célula blanco, o ambas cosas es requerido. A partir de ello, se cree que pueden existir tres grandes métodos en los que puede ocurrir el control celular: (1) señalización mediada por receptores, (2) fusión directa, e (3) internalización (Fig. 3). En el caso de la señalización mediada por receptores, los exosomas exhiben hacia el espacio extraluminal un determinado ligando que interactúa con un receptor localizado en la superficie de la célula blanco, induciendo la activación de vías moleculares de transducción de señales que desencadenarán un determinado efecto en la célula. Por su parte, tanto en la fusión directa como internalización, existe entrega del contenido vesicular con ciertas diferencias: en la primera, existirá una interacción directa entre las membranas plasmática y vesicular, ocurriendo una consecuente fusión de ellas; mientras en la segunda, se generará una endocitosis mediada por receptores. La participación de la ruta endocítica en la internalización implicará la formación de cuerpos multivesiculares, en los cuales puede ocurrir liberación del contenido vesicular por fusión directa de membranas o por participación de los lisosomas. Adicionalmente, fenómenos de transcitosis pueden ocurrir, no involucrando liberación del contenido exosomal en la célula blanco.

De las tres vías mencionadas, existen abundantes datos sobre la tercera. Sin embargo, se requirieren de estudios aún más acabados que permitan comprobar de forma definitiva la ocurrencia de la primera y segunda.

- Enfermedades y exosomas: biomarcadores

Interesantemente, el contenido de los exosomas parece cambiar según el estado fisiológico de las células; es decir, el número de copias y tipo de molécula parece variar según la condición en la que las células se encuentren. En este sentido, parece existir un perfil molecular, con una abundancia de proteínas y ARNs específicas para cada condición. De ello, con cada estado fisiológico existen patrones diferenciales de ubiquitinaciones, interacciones microARN-ribonucleoproteínas, etc., que se reflejarán en contenidos diferenciales al interior de los exosomas. Por lo tanto, el análisis del contenido de cada exosoma, puede evidenciar los eventos que están ocurriendo temporalmente en su célula progenitora.

En su aspecto más básico, las enfermedades implican un cambio en el estado fisiológico, que afecta sistémicamente a diferentes grupos celulares. Si pensamos que las células se encuentran en constante intercambio de sustancias con su medio, es posible detectar que en fluidos como la sangre se encuentren grupos de exosomas de distinto origen celular. Entonces, si se estudia comparativamente el contenido vesicular de pacientes control (sin la enfermedad) y afectados, podría efectuarse un perfil molecular diferencial para ambos casos, los que podrían ser empleados para el diagnóstico diferencial de la enfermedad en la clínica.
Respecto a esto último, diversos equipos de investigación han centrado sus esfuerzos en la caracterización comparativa marcadores en sangre total. De estos estudios, se ha obtenido interesantes resultados, como cambios en el contenido de microARNs como miR-26 y miR-128a durante estrés post-traumático, disminución de miR-92 y miR-30 en esquizofrenia y enriquecimiento de miR-26 y miR-505* en depresión.

Si bien estos resultados son prometedores en las mencionadas patologías del sistema nervioso, los exosomas ofrecen tres grandes ventajas adicionales que resultan interesantes a la hora de emplearlos como biomarcadores. En primera instancia, la abundancia de lípidos principalmente saturados ofrece un incremento de la rigidez de las membranas, haciendo a los exosomas vesículas más resistentes y otorgando una mayor protección del contenido molecular interno (tanto proteico como nucleico). En segundo lugar, la presencia diferencial de algunas proteínas en la membrana exosomal puede permitir la identificación específica de la fuente celular, permitiendo aislar las vesículas mediante el uso de columnas de afinidad o inmunoprecipitación y estudiar selectivamente su contenido. En tercer lugar, una vez que la fuente celular haya sido identificada, el análisis del contenido puede revelar el estado celular de órganos de difícil estudio in vivo (como el cerebro), pudiendo identificarse grupos de biomarcadores de mayor especificidad que permitan, e incluso, clasificar subtipos de patologías.

Sin embargo, uno de los grandes desafíos a la hora del estudio de los exosomas lo constituye su purificación. Esta puede llevarse a cabo mediante métodos físicos (como la ultracentrifugación en gradientes, a velocidades sobre los 100.000 x g) o mediante el uso de marcadores de superficie (empleo de anticuerpos anti-tetraspaninas, como CD63). Estas técnicas implican una gran inversión en términos de equipamiento, reactivos y tiempo, que en lo clínico puede conllevar a aumentos en los precios de los bioanálisis. Sin embargo, una de las tendencias internacionales que paulatinamente se encuentra en masificación, son las alianzas estratégicas entre centros médicos y laboratorios de investigación. Estas incorporaciones de los laboratorios en la clínica, podrían ayudar a sobrellevar estos problemas. Así mismo, diversas compañías biotecnológicas han diseñado kits de purificación rápida de exosomas, con mejores especificaciones respecto a sus primeras versiones, y que permiten rápidamente purificar estas vesículas de forma específica al tipo de fuente.

Finalmente, los exosomas se muestran como una interesante fuente de biomarcadores que, a la fecha, continúa en constante investigación. Cada día, un nuevo biomarcador aparece en revistas especializadas en la materia, pero pocos de ellos ofrecen tanta versatilidad como los exosomas en cuanto al estudio de grupos de moléculas. Desgraciadamente, disponemos de poca información respecto a los mecanismos que se relacionan con la biogénesis, exportación, transporte, entrega y efectos celulares. Sin duda, aún nos quedan muchas horas de trabajo en el laboratorio.

Más información:

M. Colombo, G. Raposo, C. Thèry. (2014). Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30: 255–89.

O. De Jong, B. Van Balkom, R. Schiffelers, C. Bouten, M. Verhaar. (2014). Extracellular vesicles: potential roles in regenerative medicine. Frontiers in Immunology 5: 1-13.

P. Vader, X. Breakefield, M. Wood. (2014). Extracellular vesicles: emerging targets for cancer therapy. Trends in Molecular Medicine. 20(7): 385-393.