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Microscopía de fluorescencia mediante hojas de luz

Principios, ventajas y potencial de la técnica declarada método del año 2014 para la investigación biológica.

El microscopio de LSFM ilumina la muestra con una fina hoja de luz (azul) que causa la excitación selectiva de las moléculas marcadoras (fluoróforos) alojadas en el plano enfocado. La fluorescencia que estas emiten es detectada luego por otra lente, situada en una dirección perpendicular a la de excitación (verde). La hoja de luz opera así como una suerte de «bisturí» virtual que, sin cortar la muestra, permite obtener una imagen del interior de la misma (seccionado óptico). [CORTESÍA DE ZEISS]

Presentamos en este artículo una de las técnicas microscópicas más novedosas y prometedoras en el campo de la biología celular, del desarrollo y de sistemas. Para comprender la importancia de las mejoras que esta ofrece, comenzaremos repasando las ineficiencias y dificultades que entrañan las técnicas tradicionales.

La microscopía mediante luz transmitida —la del microscopio clásico— muestra una visión completa de la morfología de los especímenes biológicos. La microscopía de fluorescencia (basada en el empleo de marcadores fluorescentes) nos permite dar un paso más y estudiar sistemas más concretos como órganos, orgánulos o macromoléculas; además, muestra las zonas de interés brillantes sobre un fondo oscuro, por lo que ofrece un buen contraste. Pero no todo son ventajas.

La microscopía de epifluorescencia estándar (la de campo amplio y la confocal) utiliza la misma lente tanto para excitar los marcadores (fluoróforos) como para capturar la fluorescencia emitida. La luz pasa primero a través del espécimen y excita el mismo número de fluoróforos en cada plano focal a lo largo del eje óptico (se supone que la distribución de estas moléculas es uniforme). De esta forma, cada vez que el microscopio se enfoca en un plano, en realidad excita también todos los fluoróforos del espécimen, incluidos los de los planos superiores o inferiores al plano focal.

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