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  • Octubre 2014Nº 457
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Reseña

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ARN

Técnicas recientes para descubrir su estructura y función.

Menear

RNA STRUCTURE AND FOLDING. BIOPHYSICAL TECHNIQUES AND PREDICTION METHODS
Dirigido por Dagmar Klostermeier y Christian Hammann. Walter de Gruyter GMBH; Berlín, 2013.

Los estudios sobre secuenciación genómica han sacado a la luz la existencia de una diversidad y complejidad inesperadas de especies de ARN. Se estima que no llega al 2 por ciento del genoma humano la fracción que codifica proteínas, por más que la mayor parte del ADN se transcriba en ARN. Se desconoce la razón biológica de esa tarea carísima desde el punto de vista energético, pero sí sabemos ya que el ARN no codificador desempeña múltiples funciones, incluidas la catálisis y la regulación génica. El ARN comprende, en efecto, un abanico extenso de fenómenos celulares. Su papel en
la traducción proteica se conoce desde hace decenios; más reciente es el conocimiento de sus actividades catalíticas, a través de ribozimas, sus actividades reguladoras, a través de microARN, pequeños ARN interferentes, ARN mensajero y ARN no codificadores. Transcrito como molécula unicatenaria, el ARN puede emparejarse consigo mismo, con otra molécula de ARN o con ADN. Puede enlazarse con numerosas macromoléculas biológicas y metabolitos celulares.

Los pormenores de su mecánica de operación dependen de la estructura. De ahí el supremo interés en el plegamiento adoptado. Y, si bien el estudio del plegamiento del ARN no es nuevo, las técnicas tradicionales ofrecen solo un cuadro promediado del comportamiento de esta molécula y no nos permiten acceder a la multiplicidad de conformaciones en las que puede plegarse, ni a los estados transitorios de su cinética. Además, las proteínas se hallan indisolublemente asociadas con el plegamiento y la estructura in vivo del ARN.

La estructura polimérica del ARN comienza con su composición química monomérica de cuatro nucleótidos estándar: adenina, citosina, guanina y uracilo. En la naturaleza, sin embargo, hay más de cien nucleótidos de ARN. Los ácidos nucleicos son moléculas muy flexibles, que, a diferencia de las proteínas, adoptan estructuras terciarias diversas para una misma secuencia. Tamaña flexibilidad en su conformación desempeña un papel crucial en sus procesos celulares. El ARN se pliega de una manera jerárquica, con la formación inicial de estructuras secundarias, regiones dúplices generadas por emparejamiento de bases.

El conocimiento pormenorizado de la dinámica molecular del ARN avanza de la mano de la determinación de su estructura terciaria. Para el análisis de la estructura y formación se recurre a la espectroscopía óptica y la calorimetría. Las sondas utilizadas en espectroscopía aportan una lectura de los cambios operados en el entorno debidos a las transiciones estructurales; las técnicas calorimétricas miden directamente el intercambio de calor producido durante esas transiciones. Los métodos espectroscópicos (resonancia magnética nuclear, infrarrojos, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, o FRET, y resonancia electrónica paramagnética) resultan apropiados para investigar la dinámica de las moléculas de ARN en diferentes escalas. La espectroscopía de resonancia magnética nuclear y los infrarrojos obtienen información estructural en una escala de longitud subnanométrica, mientras que la espectroscopía FRET y la espectroscopía de resonancia electrón-electrón aportan información para distancias en el rango de 1 a 10 nanómetros.

A lo largo de los últimos diez años hemos asistido a progresos sin precedentes en la bioquímica del ARN. Tras el crucial descubrimiento de la interferencia por ARN, por Andrew Fire y Craig Cameron, como mecanismo central de la post-transcripción de la regulación génica, se entiende la participación de moléculas de ARN no codificadoras en vías reguladoras de todos los niveles del flujo de información genética. Las funciones del ARN se fundamentan en su capacidad para adoptar estructuras tridimensionales únicas que son específicamente reconocidas por los ligandos. Las reglas estructurales que gobiernan las interacciones ARN-ligandos se basan en la identificación de los nucleótidos y los átomos implicados en el reconocimiento específico, y en mecanismos en cuya virtud ARN y ligando se adaptan entre sí. En ausencia de estructuras de alta resolución, los enfoques bioquímicos y genéticos han permitido cartografiar el sitio de enlace con el ligando (footprinting de ARN), para aportar información topográfica sobre complejos ligando-ARN y para identificar contactos específicos y su respectiva contribución al enlace.

La bioconjugación específica y las estrategias de marcaje del ARN desempeñan funciones importantes para diversas aplicaciones de la bioquímica del ARN. Las investigaciones in vitro de la estructura y función del ARN mediante métodos espectroscópicos requieren la incorporación específica de sitio de marcadores de los grupos funcionales. Los estudios sobre síntesis, localización y maduración de ARN que aplican técnicas de imagen exigen la agregación selectiva de cromóforos para la visualización. A las reacciones de marcaje ideal se les exige precisión en la selectividad y proceder bajo condiciones que sean compatibles con la naturaleza delicada del ARN. Se están haciendo cada vez más habituales la microscopía de muy alta resolución y la espectroscopia de fluorescencia unimolecular.

Se recurre a la electroforesis en un gel de poliacrilamida para recabar información angular relativa sobre la disposición de los brazos helicoidales en las articulaciones nucleoacídicas. Aunque en un principio se aplicó al ADN, se generalizó para investigar las moléculas de ARN. Se trata de un método que no requiere instrumentos complicados o carísimos; su talón de Aquiles se esconde en que la electroforesis carece de un riguroso marco teórico si la comparamos con otros métodos estructurales, de suerte que las conclusiones que emergen no suelen caer en el dominio de lo cuantitativo. Mientras que podemos determinar la simetría de una articulación determinada, sus ángulos coaxiales se miden solo en un sentido muy relativo. Sin embargo, la comparación de los ángulos puede frecuentemente aportar información suficiente para una buena descripción de la estructura. Este método de electroforesis en gel comparada se desarrolla a menudo en conjunción con otros métodos biofísicos, en particular con el empleo de la FRET. Los tratamientos teóricos de la electroforesis en gel de los ácidos nucleicos se basan en el concepto de reptación: el ADN y el ARN migran, «serpenteando», a lo largo de un tubo formado por matriz polimérica de un gel. La electroforesis es un método sencillo, muy poderoso, para el estudio de la conformación global de las articulaciones helicoidales del ARN. También es un método muy mal entendido, no cuantitativo en sentido estricto, de muy baja resolución. Su nivel de detalle dista mucho del alcanzado por la cristalografía. La electroforesis en gel es mucho más simple y rápida que la cristalografía y, por supuesto, no requiere cristal alguno. La electroforesis en gel comparada descubrió la estructura en X empaquetada de la articulación Holliday del ADN diez años antes de que la observaran los cristalógrafos. El método ha desempeñado un papel destacado en la interpretación de la estructura de diversos sistemas de ARN.

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia es una transferencia no radiativa de energía desde un cromóforo donante hacia un cromóforo aceptor a través de una interacción espacial de sus dipolos de transición. La eficiencia de ese proceso depende de la distancia que separa las tinciones fluorescentes. El marco teórico para la descripción cuantitativa de la FRET y su distancia fue formulado por Theodor Förster. Numerosos estudios han validado la FRET como una poderosa técnica de fluorescencia para medir distancias intramoleculares en macromoléculas y seguir cambios en la distancia causados por cambios conformacionales. En particular, la técnica FRET resulta indicada para estudiar extensos multidominios o multicomponentes que se caracterizan, además, por su flexibilidad y no pueden abordarse por resonancia magnética nuclear ni cristalografía de rayos X. De ahí su enorme interés en la investigación sobre el ARN y los complejos ARN-proteína.

Por su parte, la microscopía de fuerza atómica ha contribuido a nuestra comprensión de la estructura del ARN vírico. Ha dado frutos espectaculares en la investigación del virus satélite del mosaico del tabaco. Mediante el uso de microscopía de fuerza atómica, pinzas magnéticas y pinzas ópticas, podemos acotar moléculas y medir fuerzas en un rango típico de entre 0,1 y 100 piconewtons. En su origen, las mediciones de fuerza se emplearon para investigar las propiedades mecánicas y los mecanismos de motores moleculares. En fecha más reciente, los estudios unimoleculares de sistemas basados en el ARN han adquirido mayor difusión, con ejemplos prominentes en el despliegue mecánico de las estructuras de ARN, la observación de helicasas de ARN vírico y los estudios sobre el ensamblaje del ribosoma.

Podemos recurrir a la aplicación de las pinzas ópticas para abordar algunos de los retos que plantea la investigación sobre la estructura y el plegamiento del ARN. Para sondear, una a una, las moléculas de ARN, necesitamos una máquina que nos permita acceder a su escala. Con una distancia entre pares de bases de menos de un nanómetro y un plegamiento que se desarrolla en el rango del milisegundo y a energías equiparables a la energía térmica, una molécula de ARN puede estudiarse con herramientas sumamente precisas. Las pinzas ópticas se originan a partir de la obra seminal deArthur Ashkin, quien descubrió que partículas dieléctricas, de una micra de tamaño, podían quedar atrapadas en el foco de un haz convergente de láser. El haz atrapador de la partícula podía actuar a modo de pinza microscópica. Para sondear una molécula de ARN con unas pinzas ópticas, hemos de empezar por aislarla y ejercer una fuerza de atracción sobre cada extremo. La molécula de ARN de interés suele ser muy pequeña para una manipulación fácil. Por consiguiente, el fragmento de ARN se incorpora a una construcción mucho mayor.

La dispersión de pequeño ángulo (SAS), o de dispersión de rayos X de pequeño ángulo (SAXS), constituye un método poderoso para el análisis de la estructura y las interacciones de macromoléculas biológicas en solución. SAXS posibilita una aproximación única a las proteínas, ácidos nucleicos y sus complejos, su plegamiento y despliegue molecular, agregación, forma, conformación y ensamblaje. Cualquier evento de dispersión está caracterizado por una ley recíproca entre tamaño de partícula y ángulo de dispersión. La radiación electromagnética incidente interactúa con los electrones en una muestra. Una parte de ellos emitirá radiación coherente. Donde las ondas interfieren constructivamente tendremos un máximo, que es lo que detectamos. Los avances en la recolección automática de datos facilitan los experimentos.

Para un examen estructural eficiente se requiere una muestra de buena calidad. Igual que los métodos de alta resolución (cristalografía molecular de alta resolución o resonancia magnética nuclear), la SAXS requiere miligramos de material muy puro y monodisperso que permanezca soluble incluso a elevadas concentraciones. Pero comparada con esos dos métodos, la SAXS tiene en su ventaja la velocidad en la recogida de datos y caracterización de la muestra. No requiere ulterior cristalización. Muchas aproximaciones al análisis de datos mediante SAXS desarrolladas para proteína se mostraron útiles para las moléculas de ARN.

La resonancia magnética nuclear en solución ofrece una poderosa ventaja
en el estudio de los ARN y sus interacciones moleculares en las soluciones fisiológicamente relevantes. La cristalografía de rayos X es la técnica más poderosa para dilucidar la estructura tridimensional de macromoléculas biológicas [véase «Aportaciones de la cristalografía a la medicina», por Juan A. Hermoso; Inves-
tigación y Ciencia, julio de 2014]. La determinación exitosa de la estructura de un ARN o de un complejo ribonucleoproteico requiere, como mínimo, la preparación de cristales bien ordenados, recogida de datos de difracción, solución experimental o computacional del problema de fases, construcción de modelo, refinamiento cristalográfico y validación de la estructura. La fuente principal de estabilidad de las estructuras del ARN es el empaquetamiento de los nucleótidos y pares de bases.

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